医院骑士团成立时只是一个行善的组织,从1120年才开始作为一个军事修会进行活动,并发展成为耶路撒冷王国的一支重要的军事力量,对耶路撒冷的政局也有很大的影响力。它在耶路撒冷王国拥有7座大的要塞,140多座其它建筑。耶路撒冷王国国王博度安四世(即《天国王朝》里那个有麻风病的年轻国王)去世后,当时医院骑士团的大团长Roger de Moulins反对居伊(Guido von Lusignan)继任,可惜没有成功。后来在1187年哈丁之战中,医院骑士团也派出主力参战,由于指挥上的失误,包括医院骑士团、圣殿骑士团在内的基督教军队几乎全军覆没,医院骑士团大团长Roger de Moulins战死。
在欧洲的7年时间里,他们多次迁徙,居无定所。到1530年,奉教皇Clement VIII和神圣罗马帝国皇帝查理五世的命令,医院骑士团来到马耳他岛,每年象征性地向西西里王国缴纳1马耳他鹰币作为租金,在岛上骑士团建立了马耳他骑士团国(Sovereign Military Order of Malta,缩写为S.M.O.M)。土耳其人对骑士团的卷土重来显然很不安,1565年,土耳其人派出大军进攻马耳他。这场大战一开始和上次在罗德岛的大战很相似:骑士团苦苦支撑,绝大多数城市都被摧毁,骑士团成员有一半战死。就在骑士团眼看要支撑不住时,从西班牙来了一支援军,战场局势顿时扭转,土耳其军队仓惶撤退,损失达到3万余人。这次大胜使马耳他骑士团国获得了一段时间的和平局面。1571年,土耳其人自以为海军发展得差不多了,再次起兵,企图消灭骑士团。不过这次他们败得更惨:还没到马耳他,在海上就遇上了西班牙的无敌舰队,土耳其舰队几乎全被击沉或俘虏。此后马耳他骑士团国进入鼎盛时期,帆上标有马耳他八角十字的战船在地中海横行无阻。